外有皮膚包裹，內部有骨骼、肌肉、韌帶、肌腱、神經和血管，
此外還有一些排列疏鬆的纖維母細胞連結、固定這些內部組織，
並賦予肢體特定外形。
然而蠑螈的腳，卻是脊椎動物界裡最獨特的，
如果斷了，牠可以從傷口重新長出完整的肢體，
而且不管斷了多少次，成年的蠑螈還是能一次又一次地長回腳來。
青蛙在蝌蚪時期剛長出來的腳也可以再生，
然而一旦進入成年期即失去了這項能力；
即便哺乳動物的胚胎也有一些能取代成長中肢芽 ( limb bud ) 的能力，
但是出生之前這項能力也會消失。
事實上，
再生能力隨生物發育程度而降低的趨勢，正好反映了高等動物形態的演化，
也讓較低等的蠑螈成為終其一生都能再生複雜肢體的唯一脊椎動物。
人們對於蠑螈的這項本領好奇已久，
再生部位是怎麼「知道」它需要取代的失去肢體有多長？
為什麼牠們斷腳處的皮膚不會像人類一樣形成封閉的疤痕？
成年蠑螈如何讓組織保持胚胎一樣的潛能，而能多次從無到有長出整段肢體？
生物學家正試圖找出這些問題的答案，
如果能了解自然界的再生機制，我們希望能誘發人體的再生，
例如長回截斷的手或腳，並改善其他嚴重傷口的癒合。
人體遭受重大創傷時的初期反應，其實和蠑螈大同小異，
但是傷口癒合的策略很快就分道揚鑣，
結果是人類無法進行再生，只會在傷口處留下疤痕。
然而有一些跡象顯示，人類應該具備再造複雜部位的潛力，
關鍵是喚醒人類潛藏的蠑螈式癒合反應。
因此，我們研究的第一步就是向再生專家蠑螈請益。
蠑螈教我們的幾件事
當蠑螈細小的腳被切斷時，截肢處的血管會立刻收縮，以減少失血，
然後會有一層皮膚細胞很快覆蓋斷肢的傷口。
在剛受傷的幾天內，這層傷口表皮層會轉變成一層傳訊細胞，稱為「頂端上皮蓋」 ( apical epithelial cap ) ，
這層細胞是再生不可或缺的關鍵。
在此同時，
纖維母細胞會掙脫結締組織網絡，移動到斷肢傷口表面的中央，然後增生形成芽基 ( blastema ) ，
這群性質類似幹細胞的芽基細胞，將做為長成新肢體的前趨細胞。
幾年前，
美國加州大學爾灣分校的布萊恩特 ( Susan Bryant ) ，
證明了蠑螈的芽基細胞和胚胎發育中的肢芽 ( limb bud ) 細胞是相同的，
顯示從芽基長成肢體的過程，其實是重演動物胚胎形成四肢的過程。
這項發現的重要意義在於不管是新生或者是再生肢體，都應用了相同的基因程式；
由於人類在胚胎時期也經歷了長出手腳的過程，理論上成人也應該擁有再生必要的基因程式，
因此科學家的目標，就是找出如何誘導斷肢形成芽基的方法。
作者賈迪納數年前曾與爾灣分校的同事遠藤哲也 ( Tetsuya Endo ) 合作，
以「化繁為簡」的策略來探究芽基如何形成的基本問題。
賈迪納並不直接研究會自然形成芽基的斷肢，
而是觀察蠑螈腿上的簡單傷口，看牠的皮膚如何再生、癒合。
我們的想法是，這類傷口類似哺乳動物無法長出新肢體的斷肢傷口，
但如果我們能讓只有簡單癒合反應的傷口也長出完整的腳，那就可以進一步分析再生過程。
我們在蠑螈腿上劃了一道小傷口，其表皮細胞便會移動到割傷處將傷口密合起來，
就像處理截肢傷口一樣，
而位於真皮層的纖維母細胞也會前往傷口來取代失去的皮膚。
但如果我們小心地將一條神經轉向受傷的地方，我們就可誘導那些纖維母細胞形成芽基。
美國凱斯西儲大學的辛格爾 ( Marcus Singer ) 在半個世紀前即已證明再生反應需要神經分佈，
但我們的實驗則證實神經提供的某些未知因子可改變附近纖維母細胞的行為，進而影響再生。
然而這些誘導形成的芽基卻無法繼續進展到後期而長出新腳，顯然我們還缺少了其他要素。
而促使芽基長成肢體的關鍵，
是移植對側肢體的皮膚到傷口，讓身體對側肢體的纖維母細胞也參與癒合反應。
這個從割傷處新長出的腳，位置當然異常了，但其解剖構造卻完全正常，
因此促進芽基形成的基本配方看來相當簡單：傷口表皮層、神經，和來自對側肢體的纖維母細胞。
有了肢體再生的基本配方後，我們即可開始釐清每一個要素所扮演的角色。
我們知道表皮層是從胚胎發育初期三個原始胚層中的外胚層衍生而成，
也知道外胚層所提供的信號分子，控制了胚胎肢芽長出四肢的過程。
外胚層細胞會聚集在肢芽處形成「頂端外胚層脊」 ( apical ectodermal ridge ) ，
這個構造會在特定時期分泌化學信號分子，引導下方肢芽細胞的移動和增生。
雖然我們尚未確定來自表皮層的關鍵信號分子為何，
但我們知道有某幾種纖維母細胞生長因子 ( fibroblast growth factor, FGF ) 參與其中。
頂端外胚層脊製造了多種FGF來刺激下方的肢芽細胞，
肢芽細胞又會製造其他種FGF，形成頂端外胚層脊和肢芽細胞間的反饋迴路，
這是生成肢體必要的機制。
一般相信，肢體再生時形成的頂端上皮蓋也會引發類似的反饋迴路。
日本東北大學的田中幹子 ( Hiroyuki Ide ) 發現，
蝌蚪逐漸喪失再生能力的現象與無法活化FGF迴路有關，
如果以FGF10處理已無法再生肢體的蝌蚪，可啟動信號迴路而刺激斷肢部份再生。
這項結果雖令人興奮，卻有一個問題：利用FGF10誘導形成的再生肢體，其內部構造發生了異常，
這個結果引發出該如何控制再生、確保新肢體有正確解剖構造的重要問題。
從這個結果又發現另一個再生的要角：纖維母細胞，它負責了這項功能。
細胞如何知道所在位置？
之前在討論化繁為簡的實驗時曾提過，
即使在簡單的傷口癒合也可見纖維母細胞的參與，
但只有纖維母細胞本身並不足以完成再生過程，
真正需要的是來自對側肢體的纖維母細胞。
這項發現顯示啟動再生反應時，細胞位置的重要性。
在胚胎發育時期，肢體的生長遵循了一定的順序：
先形成肢體的基部，像是肩或臀，然後逐步組成較遠端的結構，
最後在手指或腳趾長出後大功告成。
然而在蠑螈再生的例子中，斷肢的位置可能發生在任何一點，
而且不管傷口位於何處，長回來的都只是被切除的部位。
這種「因地制宜」的反應顯示，斷肢傷口邊緣的細胞必定「知道」自己在整段肢體的相對位置，
有了這樣的位置資訊，再透過各種基因的活性來操控細胞和分子，才能長出完美的替代肢體。
找出再生過程中有哪些基因活化，將有助於了解再生階段的控制機制。
雖然在胚胎發育時期有許多基因教導細胞認清自己所在位置，
但其中有一群稱為Hox的基因格外重要。
大部份動物發育中的肢芽細胞，都是利用Hox基因提供的位置密碼來引導肢體的生長，
但是當細胞後來分化成為特化組織時，它們會「遺忘」這些資訊。
相對地，成年蠑螈的纖維母細胞則始終記得這套資訊系統，並會於肢體再生時再次取用Hox的位置密碼。
肢體再生時，纖維母細胞帶著位置資訊來到傷口，並啟動芽基的形成；
一旦進入芽基後，細胞會「討論」傷勢的嚴重性，
它們的談話內容現在還無從得知，
但可確定獲得的結論之一是先建立再生肢體的邊界，包括手或足的輪廓，
如此細胞即能使用它們的位置資訊來填補從斷肢面到手指或腳趾之間失去的部位。
由於肌肉和骨骼是肢體的最主要組成，我們也想了解這些組織的原始素材來源以及控制它們形成的機制。
當再生反應啟動時，初期關鍵事件中有一項是我們所知甚少的「去分化」。
去分化一般是形容細胞從成熟特化狀態回復到原始的胚胎狀態，
因此而獲得了增生的能力，並可做為衍生出一種或多種組織的前驅細胞。
然而在再生研究領域裡，最早出現去分化一詞，
是因為在顯微鏡下觀察到蠑螈殘肢組織 ( 特別是肌肉 ) 似乎會分解，然後細胞增生形成芽基。
我們現在知道那些肌肉相關細胞，
其實是由平常位於肌肉組織中的幹細胞衍生而成的，而非來自肌肉細胞的去分化。
究竟肢體再生時每種組織類型是否會發生去分化，仍有待查證，
不過顯然再生期間確實有去分化現象發生，
舉例來說，進入芽基並轉變為較原始芽基細胞的纖維母細胞，
有能力分化成骨骼組織 ( 硬骨和軟骨 ) ，也可以形成新肢體的間質網狀結構。
讓我們回到讓芽基形成的另一個重要細胞：表皮細胞，
我們甚至還能指出再生過程中，這些細胞何時轉變成胚胎狀態。
在胚胎肢體形成時，外胚層中有一些基因的活性至為重要，例如Fgf8和Wnt7a，
但是當外胚層分化為成體的多層表皮層時，這些基因就會關閉。
當成年蠑螈再生時，
移動到斷肢傷口並準備建造傷口表皮層的皮膚細胞，會有一些基因開始活化，
像是製造與傷口癒合有關的角質蛋白 ( keratin ) ，不過這些基因的活化並不局限於再生過程。
之後傷口表皮層細胞也會活化Fgf8和Wnt7a兩個重要的發育基因。
而實際上不管是發生在表皮層和其他細胞類型，
「去分化」的基本定義就是活化胚胎發育時期特定的關鍵基因。
因此，
我們從蠑螈的研究看出了再生過程可劃分為幾個重要階段，
首先是傷口癒合反應，
接著是回復到某種胚胎狀態的細胞形成芽基，
最後是啟動發育程式重建新肢體。
當我們面對誘導人類肢體再生的挑戰時，這些資訊將可指引我們努力的方向。
事實上，
科學最困難的就是發現那些尚未發生的東西，而人類肢體再生肯定屬於這個範疇，
不過這並不是說人類就不具有自然的再生能力。
指尖上的一線希望
再生人類肢體是個遙不可及的目標嗎？
有件事實為我們帶來一線希望：人類的指尖原本就具有再生能力。
指尖再生最早在30多年前一名幼童的身上觀察到，
之後陸續有報告發現青少年、甚至成人也有類似的現象。
當人類指尖遭遇斷肢傷害時，只需要清潔傷口和簡單包紮即可促進再生，
如果讓傷口自然癒合，指尖的外形、指紋和感覺都會恢復，而且會長到適當長度，
醫學期刊上有數千個以這種保守方法來治療指尖截斷傷口的成功案例。
有趣的是，
治療截斷傷口的另一種方法，通常是以手術將皮膚縫到傷口上，
我們現在知道這種治療法會抑制再生，即使應用在蠑螈身上也一樣，
因為這樣會干擾傷口表皮層的形成。
這些報告所傳達的訊息是：人類也有潛在的再生能力，
可惜這個潛能往往被我們傳統的醫療方法所抑制。
要研究人類指尖如何自然再生並不容易，畢竟我們不能到處切斷人的指頭來做實驗，
但有幾名研究人員證明幼鼠和成鼠有相同的反應。
作者宗岡賢和韓萬鍾 ( 音譯 ) 最近幾年來對小鼠指尖再生反應進行了詳細的研究，
我們驗證小鼠在趾尖切除後，確實會形成傷口表皮層，但其再生覆蓋傷口的速度比蠑螈慢多了。
我們還證明小鼠趾尖再生時，
傷口處一群未分化的增生細胞內會表現重要的胚胎基因，顯示這群細胞就是芽基細胞，
此外還有間接證據指出，它們是從位居間質結締組織和骨髓的纖維母細胞衍生出來的。
為了探討小鼠趾尖再生反應中特定基因和生長因子的角色，
我們發展了培養組織做為胚胎小鼠趾尖再生的研究模型。
我們發現，如果移除一種稱為「促骨生成蛋白4」 ( BMP4 ) 的生長因子，就會抑制再生；
此外我們也證明，因突變而缺乏Msx1基因的小鼠無法再生腳趾尖。
在胚胎趾尖的生長過程中，Msx1對BMP4的製造至為重要，
如果我們在缺乏Msx1基因小鼠的切除傷口上給予BMP4，即能恢復再生，
證實BMP4在再生過程的必要性。
美國紐澤西州羅伯伍德強生醫學院的阿巴蒂–沈 ( Cory Abate-Shen ) 和同事也證實，
在胚胎發育期間，Msx1所製造的蛋白質會抑制多種細胞類型的分化，
它和控制分化間的關聯，顯示了在再生反應中它可能是造成細胞去分化的原因。
雖然Msx1在蠑螈肢體再生初期去分化階段並未活化，
不過同家族的Msx2卻是再生時最先啟動的幾個基因之一，並且可能執行了類似的功能。
挑戰人類肢體再生
雖然目前看來，
讓人類手足再生仍像異想天開，而非能具體實現的目標，
但從上述種種資訊和知識，我們可以評估分析該如何實現這個目標。
當人類手腳遭遇截肢時，會產生大面積且複雜的傷口，
橫斷多種組織，包括表皮層、真皮層、間質結締組織、脂肪組織、肌肉、骨骼、神經和血管，
逐一檢視這些不同類型的組織，
我們發現它們在遭遇小型外傷時，大都具有不錯的再生能力。
事實上，肢體內缺乏再生能力的組織是真皮層，
它由多種細胞構成，其中許多屬於纖維母細胞，也就是在蠑螈再生反應中扮演了關鍵角色的細胞。
人類或其他哺乳動物受傷後，這些細胞會經歷「纖維化」的過程，
堆疊雜亂無章的細胞外間質網絡來「癒合」傷口，最後形成傷疤組織。
蠑螈能夠再生而哺乳動物無法再生的最顯著差異是，
哺乳動物的纖維母細胞會形成傷疤，蠑螈則否。
哺乳動物的纖維化反應不僅會阻礙再生，纖維化本身即是一個非常嚴重的醫學問題，
許多器官 ( 例如心臟和肝臟 ) 在受傷或生病後，器官功能會因纖維化而受到永久損害。
科學家對深層傷口的研究顯示，
至少有兩類纖維母細胞會在傷口癒合時現身，
一種是原本位於真皮層的纖維母細胞，
另一種則是存在於血液中、類似幹細胞的循環纖維母細胞。
兩種纖維母細胞都會受趕往傷口的免疫細胞發出的信號所吸引，
一旦進入傷口，這些纖維母細胞會移動並增生，然後製造並修飾傷口的細胞外間質。
這個初期反應和蠑螈並無太大差異，
但哺乳動物的纖維母細胞會製造過量的細胞外間質，
當傷疤組織成熟時，這些間質也會產生異常的交聯。
相對地，蠑螈的纖維母細胞在復原了正常的架構後，
就會停止製造間質。
然而哺乳動物這種模式也有例外的時候，
當胚胎皮膚受傷癒合時，並不會形成傷疤，而是完美再生出皮膚，
顯示隨皮膚發育成熟，細胞會趨向纖維化反應。
雖然這個差異可能反映了纖維母細胞的改變，
但更有可能是因胞外傷口環境信號的改變，而影響了纖維母細胞的行為，
也就是說，
在治療時若能控制那些信號，或許就能調整癒合反應。
不過，哺乳動物在胚胎發育時期截肢便無法再生的事實也提醒了我們，
癒合時不形成傷疤雖然是必要的，但光憑這點並不足以完成再生。
為了進一步了解什麼樣的條件可誘導人類肢體再生，我們將繼續小鼠的研究。
我們研究團隊闡述了小鼠斷肢傷口處自然形成的芽基，
下一年度的目標將是誘導正常時並不會形成芽基的傷口產生芽基，
就像讓蠑螈簡單傷口長出腳的實驗，
它將可協助我們確定芽基形成的基本條件。
我們希望這條研究路線還能澄清我們的懷疑：芽基本身可能提供了重要的信號，來防止傷口纖維化。
如果我們能在哺乳動物身上成功產生芽基，
接下來最大的挑戰將是誘騙腳趾截斷處長出完整的腳趾。
這個任務比再生簡單的指尖要複雜許多倍，
因為完整的腳趾還包括了關節，這是動物胚胎發育時形成的最複雜骨骼構造。
發育生物學家目前正試圖釐清關節形成的自然機制，
因此若能誘導小鼠形成包括關節在內的完整腳趾，將會是再生領域的重大里程碑。
我們希望能在未來幾年內達成這個目標，然後再挑戰整個小鼠腳掌，
那時候，再生前臂看起來就不會那麼遙不可及了。
事實上，回顧我們從各種動物模型研究學到的癒合和再生知識，可得到令人驚訝的結論：
只要再過10年或20年，我們可能就可以再生人類的器官肢體。
蠑螈再生反應中纖維母細胞的行為，和哺乳動物纖維化最後形成傷疤的強烈對比，
暗示成功的再生之路必須循著纖維母細胞這條線索。
美國史丹佛大學的張元豪和任職哈佛醫學院的瑞恩 ( John L. Rinn ) 最近有一項同樣令人振奮的發現：
成人的纖維母細胞和蠑螈的纖維母細胞一樣，也保有胚胎發育初期建立各肢體部位的空間座標系統。
考慮蠑螈再生時位置資訊的必要性，
人類纖維母細胞的這項系統，增加了使用並活化發育程式來再生肢體的可行性。
現在當我們觀察蠑螈長回一隻腳時，將不再全然困惑於這是怎麼辦到的，
或許在不久的將來，人類也能掌握這項驚人的能力，
以再生的新器官或肢體來取代罹病和受損的部位。
( 本文原載於科學人第75期2008年5月號 )
呼~
很長的文章, 看完的給自己拍拍手!!
